З 1867 р. навчався у Харківському повітовому училищі. 1874 р. вступив до Харківської духовної семінарії, але не закінчив її і 1877 р. вступив до Харківського університету на історико-філологічний факультет.
Після закінчення університету в 1881 р. був залишений як обдарований студент позаштатним стипендіатом для підготовки до професорського звання. Водночас працює у 3-й Харківській чоловічій гімназії викладачем історії. З 1897 року, відмовившись від офіційно запропонованої на факультеті теми з загальної історії, починає студіювати історію Запорожжя.
У 1881-1882 роках вийшла перша його праця — «Виникнення і будова Запорозького Коша», за що його було позбавлено університетської стипендії. Здійснює експедиції по місцях Запорозької Січі. З весни 1884 року читає серію публічних лекцій під назвою «Про запорозьких козаків», бере участь у роботі Історико-філологічного товариства разом з О. Потебнею, М. Сумцовим, Д. Багалієм, П. Єфименком. 1884 р. університетське начальство за сепаратизм та відверте українофільство звільняє Яворницького з посади в університеті.
Позбавлений засобів до існування і можливості займатися улюбленою працею, 1885 р. він переїжджає до Петербурга, де знайомиться з І. Рєпіним, О. Сластьоном, Д. Мордовцевим, М. Микешиним, пише низку статей з історії Запорожжя, передмову до поеми «Гайдамаки», що вийшла російською мовою з ілюстраціями О. Сластьона. Невдовзі за політичну неблагонадійність Яворницького знову позбавлено права викладати і звільнено з роботи.
1888 року опубліковано двотомник «Запорожжя у залишках старовини і переказах народу»та «Збірник матеріалів для історії запорозьких козаків».
У 1891 р. Яворницький повертається до Харкова в пошуках роботи, але, не знайшовши її, знову їде в Петербурґ.
Навесні 1892 р. виходить перший том «Історії запорозьких козаків», а через деякий час Яворницького посилають у трирічне відрядження, а фактично висилають у Середню Азію, де він працює молодшим чиновником особливих доручень при туркестанському генерал-губернаторі в Самарканді.
У 1895 p., відбувши заслання, вчений від'їжджає до Варшави, планує скласти у Варшавському університеті магістерський іспит. 3 1897 р. Яворницькому дозволено жити в Москві, де він стає приват-доцентом Московського університету. 1902 року захистив у Казанському університеті магістерську дисертацію. Того ж року переїхав до Катеринослава, став директором Музею старожитностей Катеринославської губернії.
3 1920 по 1933 рік працював в Інституті народної освіти у Катеринославі, у 1925-1929 році завідував кафедрою українознавства, був професором. 3 1927 року — відповідальний керівник експедиції з виявлення старожитностей під час будівництва Дніпрогесу. До останніх днів життя завідував Дніпропетровським історичним музеєм, брав участь у численних експедиціях по місцях Запорозької Січі.
Крім фундаментальної «Історії Запорозьких козаків»у трьох томах (1892-1897), написав ще понад двісті праць, присвячених здебільшого українській історії. Виступав також як поет і прозаїк, уклав «Словник української мови»(1920). З 1929 року — дійсний член Академії наук УРСР.
Помер Дмитро Іванович Яворницький 5 серпня 1940 року. Поховано видатного вченого у Дніпропетровську, на території створеного ним музею, що носить його ім'я.
Основні твори: «Історія запорозьких козаків», «Словник української мови».